β淀粉樣蛋白40（Aβ40）試劑盒（ELISA）（種屬：人）

實驗原理

試劑盒采用(yong)雙抗體一步夾(jia)心法酶(mei)聯(lian)免(mian)疫吸(xi)附試驗（ELISA）。往預(yu)先包被(bei)人β淀粉(fen)樣蛋白40（Aβ40）捕獲抗體的(de)(de)包被(bei)微孔中，依次加入標(biao)本、標(biao)準品、HRP標(biao)記的(de)(de)檢(jian)測(ce)抗體，經過溫(wen)育(yu)并洗滌。用(yong)底物TMB顯色，TMB在(zai)過氧(yang)化物酶(mei)的(de)(de)催(cui)化下(xia)轉化成藍色，并在(zai)酸的(de)(de)作(zuo)用(yong)下(xia)轉化成最終(zhong)的(de)(de)黃色。顏色的(de)(de)深淺和樣品中的(de)(de)人β淀粉(fen)樣蛋白40（Aβ40）呈(cheng)正相關(guan)。用(yong)酶(mei)標(biao)儀在(zai)450nm 波(bo)長下(xia)測(ce)定吸(xi)光度（OD 值），計算(suan)樣品濃(nong)度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組(zu)(zu)織勻(yun)漿(jiang)(jiang)：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗(xi)組(zu)(zu)織，去除殘留血(xue)液（勻(yun)漿(jiang)(jiang)中(zhong)裂解(jie)的紅細胞(bao)會影響測(ce)量(liang)結果），稱(cheng)重(zhong)后將組(zu)(zu)織剪碎。將剪碎的組(zu)(zu)織與對(dui)(dui)應體(ti)積(ji)的PBS（一般按1:9的重(zhong)量(liang)體(ti)積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的組(zu)(zu)織樣品(pin)對(dui)(dui)應9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積(ji)可根據實驗需要適當調整，并(bing)做好(hao)記錄。推薦在PBS中(zhong)加入蛋白(bai)酶抑制劑）加入玻璃勻(yun)漿(jiang)(jiang)器(qi)中(zhong)，于冰上充分(fen)研(yan)磨。為了進(jin)(jin)一步裂解(jie)組(zu)(zu)織細胞(bao)，可以對(dui)(dui)勻(yun)漿(jiang)(jiang)液進(jin)(jin)行超聲破碎，或反(fan)復凍融。最后將勻(yun)漿(jiang)(jiang)液于5000×g離(li)心5~10分(fen)鐘，取上清檢測(ce)。

4.  細(xi)胞培(pei)養物(wu)上清或其它(ta)生物(wu)標本：請1000×g離心20分(fen)鐘(zhong)，取上清即可檢測，或將(jiang)上清置于-20℃或-80℃保存，但應(ying)避(bi)免反(fan)復凍融(rong)。

注(zhu)：標本溶血會影響(xiang)最后檢測(ce)結果，因此(ci)溶血標本不宜進行(xing)此(ci)項檢測(ce)。

需要而未提(ti)供的試劑和器(qi)材

1. 酶(mei)標儀(yi)（450nm）

2. 高精度加(jia)樣器(qi)及槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫(wen)箱

4. 蒸餾水或去(qu)離子(zi)水

試劑盒組成

備注：

1.  標準(zhun)品(pin)濃度依次為：500、250、125、62.5、31.25、15.625 pg/mL

2.  經過(guo)大量正常(chang)標(biao)(biao)本(ben)(ben)檢(jian)(jian)驗，標(biao)(biao)本(ben)(ben)的正常(chang)濃度(du)值(zhi)均在(zai)試(shi)劑盒提(ti)供的檢(jian)(jian)測范圍內，實驗過(guo)程(cheng)中直接(jie)取50μL樣(yang)本(ben)(ben)上樣(yang)即可。當(dang)有(you)部分樣(yang)本(ben)(ben)值(zhi)超過(guo)最大標(biao)(biao)準品濃度(du)時，可用(yong)樣(yang)本(ben)(ben)稀釋(shi)液將標(biao)(biao)本(ben)(ben)進行適當(dang)稀釋(shi)后再進行實驗。

注意事項

1. 嚴格按照規定(ding)的時(shi)間(jian)和溫度進行溫育以保證準確結果。所(suo)有試劑都(dou)必須(xu)在使用前達到(dao)室溫20-25℃。使用后立即冷藏(zang)保存試劑。

2. 洗板不(bu)正確(que)可以導致不(bu)準(zhun)確(que)的結(jie)果。在(zai)加(jia)入底物前確(que)保盡量吸干孔內液(ye)體。溫(wen)育過程(cheng)中不(bu)要(yao)讓微孔干燥(zao)掉。

3. 消(xiao)除(chu)板底殘留的液體和手指印，否則影(ying)響(xiang)OD值。

4. 底物顯(xian)色(se)(se)液應(ying)呈無色(se)(se)或很淺的(de)顏(yan)色(se)(se)，已經變藍的(de)底物液不能(neng)使(shi)用。

5. 避免(mian)(mian)試劑和(he)標本(ben)的(de)交叉污染以免(mian)(mian)造成錯誤(wu)結果。

6. 在儲存(cun)和溫育時避免強光直接(jie)照(zhao)射。

7. 平衡(heng)至(zhi)室溫后再打開(kai)密(mi)封袋(dai)以防水滴(di)凝聚在冷板條(tiao)上。

8. 任何反應試(shi)劑不能接觸(chu)漂白(bai)溶(rong)劑或漂白(bai)溶(rong)劑所散發的強(qiang)烈氣(qi)體。任何漂白(bai)成分都會破壞試(shi)劑盒中反應試(shi)劑的生物(wu)活性。

9. 不能使用過期產品(pin)。

10. 如果可能傳播(bo)疾(ji)病，所(suo)有的樣(yang)(yang)品(pin)都應管(guan)理(li)好，按照規定的程序(xu)處理(li)樣(yang)(yang)品(pin)和檢測裝置。

試劑準備

試劑盒從(cong)冷藏環(huan)境(jing)中取出(chu)應在室溫平衡后方可使用。

20×洗(xi)(xi)滌(di)緩沖液(ye)的稀釋：蒸(zheng)餾(liu)水(shui)按1：20稀釋，即1份20×洗(xi)(xi)滌(di)緩沖液(ye)加(jia)19份蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

操作步驟

1.  從室(shi)溫平衡20min后的(de)鋁箔袋中取出所需板條(tiao)，剩余板條(tiao)用自(zi)封袋密封放(fang)回4℃。

2.  設置標(biao)準(zhun)品(pin)孔和樣本孔，標(biao)準(zhun)品(pin)孔各加不(bu)同濃度的標(biao)準(zhun)品(pin)50μL；

3.  樣本孔中加入待測(ce)樣本50μL；空白(bai)孔不加。

4.  除(chu)空(kong)白孔(kong)外，標準品孔(kong)和樣本孔(kong)中每孔(kong)加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用(yong)封(feng)(feng)板(ban)膜封(feng)(feng)住反應孔(kong)，37℃水浴鍋(guo)或恒(heng)溫箱溫育(yu)60min。

5.  棄去液(ye)體，吸(xi)水紙上(shang)拍干，每(mei)孔加(jia)滿洗(xi)滌(di)液(ye)（350μL），靜置(zhi)1min，甩去洗(xi)滌(di)液(ye)，吸(xi)水紙上(shang)拍干，如此(ci)重復洗(xi)板(ban)5次(ci)（也可(ke)用(yong)洗(xi)板(ban)機洗(xi)板(ban)）。

6.  每孔(kong)加入底物A、B各50μL，37℃避光(guang)孵育15min。

7.  每孔加入(ru)終止液50μL，15min內，在450nm波(bo)長處測(ce)定(ding)各孔的OD值(zhi)。

實驗結果計算

以所(suo)測標準品(pin)的(de)OD值為橫坐(zuo)(zuo)標，標準品(pin)的(de)濃(nong)度值為縱坐(zuo)(zuo)標，在坐(zuo)(zuo)標紙上(shang)或用相關軟件繪制標準曲線(xian)，并(bing)得到直線(xian)回歸方(fang)程，將樣(yang)品(pin)的(de)OD值代入方(fang)程，計(ji)算出樣(yang)品(pin)的(de)濃(nong)度。

試劑盒性能

1.  檢測范(fan)圍：15.625 pg/mL – 500 pg/mL。

2.  靈敏度(du)：檢測濃(nong)度(du)小于(yu)1.0 pg/mL。

3.  特異(yi)性(xing)(xing)：不與其它可溶性(xing)(xing)結構類似物交叉反(fan)應。

4.  重復性：板內變異系數(shu)小于(yu)10% ，板間變異系數(shu)小于(yu)15% 。