Human VASH1 ELISA定量檢測

本(ben)試劑盒用于體(ti)外定量(liang)檢(jian)測(ce)血清、血漿、組織勻漿及相(xiang)關(guan)液體(ti)樣本(ben)中人血管抑制蛋白1（VASH1）的含(han)量(liang)。

l 有效期：6個月

l 保(bao)存條件：2-8℃

l 本試(shi)劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診(zhen)斷

實驗原理

試(shi)劑盒(he)采用(yong)(yong)雙抗體一步(bu)夾(jia)心法酶聯免疫吸(xi)附試(shi)驗（ELISA）。往預先包被人血(xue)管抑制蛋白1（VASH1）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入(ru)標本、標準品(pin)、HRP標記的檢測(ce)抗體，經過(guo)溫育并洗滌(di)。用(yong)(yong)底物(wu)TMB顯色，TMB在過(guo)氧化(hua)物(wu)酶的催化(hua)下轉(zhuan)(zhuan)化(hua)成(cheng)藍色，并在酸的作用(yong)(yong)下轉(zhuan)(zhuan)化(hua)成(cheng)最終的黃色。顏色的深淺和樣品(pin)中的人血(xue)管抑制蛋白1（VASH1）呈正相關。用(yong)(yong)酶標儀在450nm 波長下測(ce)定(ding)吸(xi)光度（OD 值），計算樣品(pin)濃度。

樣本處理及要求

1.  血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.  組織(zhi)(zhi)勻(yun)漿：用預冷的(de)(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織(zhi)(zhi)，去除(chu)殘留血液(ye)（勻(yun)漿中(zhong)裂解的(de)(de)紅(hong)細(xi)胞會(hui)影響(xiang)測量(liang)結果），稱重(zhong)后將(jiang)組織(zhi)(zhi)剪碎。將(jiang)剪碎的(de)(de)組織(zhi)(zhi)與(yu)對(dui)應體積(ji)的(de)(de)PBS（一(yi)般(ban)按1:9的(de)(de)重(zhong)量(liang)體積(ji)比(bi)，比(bi)如1g的(de)(de)組織(zhi)(zhi)樣品對(dui)應9mL的(de)(de)PBS，具(ju)體體積(ji)可根據(ju)實驗需要適當調整，并做好記錄。推(tui)薦在PBS中(zhong)加入(ru)蛋白酶抑制劑）加入(ru)玻璃勻(yun)漿器中(zhong)，于冰上充分研磨。為(wei)了進一(yi)步裂解組織(zhi)(zhi)細(xi)胞，可以(yi)對(dui)勻(yun)漿液(ye)進行超(chao)聲破碎，或(huo)反(fan)復凍融。最后將(jiang)勻(yun)漿液(ye)于5000×g離心(xin)5~10分鐘，取上清檢測。

4.  細(xi)胞培養物上清或其它生(sheng)物標本：請1000×g離心20分鐘，取(qu)上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避(bi)免(mian)反(fan)復(fu)凍融。

注：標(biao)本(ben)溶血會影(ying)響最后檢(jian)測(ce)結果(guo)，因此溶血標(biao)本(ben)不(bu)宜(yi)進(jin)行此項檢(jian)測(ce)。

需要而未提(ti)供的試劑(ji)和器(qi)材

1. 酶(mei)標儀（450nm）

2. 高精(jing)度加(jia)樣器及(ji)槍(qiang)頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫(wen)箱

4. 蒸餾水或去離(li)子水

試劑盒組成

備注：

1.  標準品濃度依次為：4000、2000、1000、500、250、125 pg/mL

2.  經過(guo)大(da)(da)量正常(chang)標(biao)本(ben)(ben)檢(jian)驗(yan)(yan)，標(biao)本(ben)(ben)的正常(chang)濃度(du)(du)值(zhi)均在試劑盒提供的檢(jian)測范圍內(nei)，實驗(yan)(yan)過(guo)程中直接取50μL樣(yang)本(ben)(ben)上樣(yang)即可(ke)。當(dang)有部分樣(yang)本(ben)(ben)值(zhi)超過(guo)最大(da)(da)標(biao)準品(pin)濃度(du)(du)時，可(ke)用樣(yang)本(ben)(ben)稀(xi)(xi)釋(shi)液將(jiang)標(biao)本(ben)(ben)進行(xing)適當(dang)稀(xi)(xi)釋(shi)后再進行(xing)實驗(yan)(yan)。

注意事項

1. 嚴格按照規定(ding)的時間和溫(wen)度進(jin)行溫(wen)育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用(yong)前達到室溫(wen)20-25℃。使用(yong)后(hou)立即(ji)冷藏(zang)保存(cun)試劑。

2. 洗(xi)板不(bu)(bu)正確(que)可以(yi)導致不(bu)(bu)準確(que)的結果。在(zai)加(jia)入底物前確(que)保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不(bu)(bu)要讓微孔干燥掉。

3. 消除板底(di)殘(can)留的液體(ti)和手指印，否(fou)則影響OD值。

4. 底(di)物顯(xian)色液(ye)應呈無色或很淺的(de)顏(yan)色，已經變藍的(de)底(di)物液(ye)不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污(wu)染以(yi)免造成錯誤結果。

6. 在儲存和溫(wen)育時避免強光直接照射。

7. 平(ping)衡至室溫后再(zai)打開密封袋以防水滴凝聚在(zai)冷板條上。

8. 任(ren)何反應(ying)試(shi)劑(ji)不(bu)能接觸漂(piao)白溶劑(ji)或(huo)漂(piao)白溶劑(ji)所散發的(de)強烈氣體。任(ren)何漂(piao)白成分都(dou)會破(po)壞(huai)試(shi)劑(ji)盒中(zhong)反應(ying)試(shi)劑(ji)的(de)生物活(huo)性。

9. 不能(neng)使用過期產品。

10. 如果可能傳播(bo)疾(ji)病(bing)，所(suo)有的樣(yang)品(pin)都(dou)應(ying)管理好(hao)，按照規定的程序處理樣(yang)品(pin)和檢(jian)測裝置。

試劑準備

試劑(ji)盒從冷藏環境中取(qu)出(chu)應在室(shi)溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩(huan)沖液(ye)的稀釋：蒸餾水(shui)按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩(huan)沖液(ye)加19份蒸餾水(shui)。

操作步驟

1.  從(cong)室溫平衡20min后的鋁箔袋中取(qu)出所需(xu)板條，剩(sheng)余板條用自(zi)封(feng)袋密封(feng)放回4℃。

2.  設置標準(zhun)品(pin)孔(kong)和(he)樣本孔(kong)，標準(zhun)品(pin)孔(kong)各(ge)加不同(tong)濃(nong)度的(de)標準(zhun)品(pin)50μL；

3.  樣(yang)(yang)本孔中加入(ru)待測(ce)樣(yang)(yang)本50μL；空白(bai)孔不加。

4.  除空(kong)白孔(kong)外，標準品孔(kong)和樣本孔(kong)中每(mei)孔(kong)加入辣(la)根過氧化物酶（HRP）標記(ji)的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔(kong)，37℃水浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5.  棄去液(ye)體，吸水(shui)紙(zhi)上拍干，每孔加滿洗滌(di)液(ye)（350μL），靜置1min，甩去洗滌(di)液(ye)，吸水(shui)紙(zhi)上拍干，如此重復洗板(ban)(ban)5次（也(ye)可(ke)用洗板(ban)(ban)機洗板(ban)(ban)）。

6.  每孔加入底物A、B各(ge)50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每(mei)孔加入終止液50μL，15min內(nei)，在450nm波長處(chu)測定各(ge)孔的OD值。

實驗結果計算

以所(suo)測標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)的(de)OD值為(wei)橫坐(zuo)標(biao)，標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)的(de)濃度值為(wei)縱坐(zuo)標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上或用相關軟件繪制標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)，并得到直線(xian)回歸方程，將樣品(pin)(pin)的(de)OD值代入方程，計(ji)算(suan)出樣品(pin)(pin)的(de)濃度。

試劑盒性能

1.  檢測范圍(wei)：125 pg/mL – 4000 pg/mL。

2.  靈敏度(du)：檢測濃(nong)度(du)小(xiao)于10 pg/mL。

3.  特異(yi)性(xing)：不與其它(ta)可溶性(xing)結構類(lei)似物交(jiao)叉(cha)反應。

 重復性：板內變異系數小于(yu)10% ，板間變異系數小于(yu)15% 。