仁捷生物：人中性粒細胞彈性蛋白酶（NE;ELA2）試劑盒（ELISA）

 本試劑盒用于體外定(ding)量(liang)檢測血清、血漿、組織(zhi)勻漿及相關液體樣本中(zhong)人中(zhong)性粒細(xi)胞彈性蛋白酶(mei)（NE;ELA2）的(de)含量(liang)。

l 有效期(qi)：6個(ge)月

l 保存條件(jian)：2-8℃

l 本試劑盒僅供(gong)科研使用，不得用于(yu)臨(lin)床診(zhen)斷(duan)

實(shi)驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lian)免(mian)疫吸(xi)附試驗（ELISA）。往(wang)預(yu)先包(bao)被人中性粒細(xi)胞(bao)彈性蛋白(bai)酶（NE;ELA2）捕獲抗體(ti)的包被微孔中，依次(ci)加入標本、標準(zhun)品、HRP標記的(de)檢測抗體(ti)，經(jing)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化(hua)物酶的(de)催化(hua)下(xia)轉化(hua)成(cheng)藍(lan)色，并在酸的(de)作用下(xia)轉化(hua)成(cheng)最終(zhong)的(de)黃色。顏色的(de)深淺和樣品中的(de)人中性粒細胞(bao)彈性蛋白(bai)酶(mei)（NE;ELA2）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長(chang)下測定(ding)吸光(guang)度（OD 值），計(ji)算樣(yang)品(pin)濃(nong)度。

樣本(ben)處理(li)及(ji)要求(qiu)

1.  血清：將收集于血(xue)(xue)清分離管(guan)的全(quan)血(xue)(xue)標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離(li)心20 分鐘，取上清(qing)即可，或將上清(qing)置(zhi)于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.  血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑(ji)采(cai)(cai)集標(biao)本(ben)，并(bing)將標(biao)本(ben)在采(cai)(cai)集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分(fen)鐘，取(qu)上清即可(ke)檢測，或(huo)將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免(mian)反復凍融。
3.  組織勻漿：用預冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組織，去除殘(can)留(liu)血(xue)液（勻漿中(zhong)裂解的(de)紅細胞會影響(xiang)測量結果），稱重(zhong)后將組織剪(jian)碎(sui)。將剪(jian)碎(sui)的(de)組織與對應體(ti)積的(de)PBS（一般按(an)1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體(ti)體(ti)積可(ke)根據實(shi)驗需要適當調整(zheng)，并做好記錄(lu)。推(tui)薦在PBS中加入蛋(dan)白酶抑制(zhi)劑）加入玻璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器中，于(yu)冰(bing)上充分研磨。為(wei)了(le)進(jin)一步(bu)裂解組織(zhi)細胞(bao)，可以對勻(yun)(yun)漿(jiang)液進(jin)行超聲(sheng)破碎，或反(fan)復凍融。最后將勻(yun)(yun)漿(jiang)液于(yu)5000×g離心5~10分鐘，取上(shang)清(qing)檢測。

4.  細胞(bao)培養物上(shang)清或其它生物標本：請1000×g離心20分(fen)鐘，取上(shang)清(qing)即可檢測，或將上(shang)清(qing)置于-20℃或-80℃保(bao)存，但(dan)應(ying)避免(mian)反(fan)復凍融。

注：標本溶血會(hui)影響最后(hou)檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

需要而未(wei)提供的(de)試(shi)劑(ji)和器材

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加(jia)樣器(qi)及(ji)槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離(li)子水

試劑盒組成

備注(zhu)：

1.  標準品濃度依次為(wei)：4、2、1、0.5、0.25、0.125 ng/mL

2.  經(jing)過大量正常標(biao)本檢(jian)(jian)驗(yan)，標(biao)本的正常濃度值均(jun)在試劑(ji)盒提供的檢(jian)(jian)測范圍內，實驗(yan)過程中(zhong)直接(jie)取50μL樣(yang)(yang)(yang)本(ben)上樣(yang)(yang)(yang)即可。當(dang)有部分樣(yang)(yang)(yang)本(ben)值超過(guo)最(zui)大標(biao)準品濃度(du)時，可用樣(yang)(yang)(yang)本(ben)稀釋液將(jiang)標(biao)本(ben)進(jin)行適當(dang)稀釋后再進(jin)行實驗。

注意事(shi)項

1. 嚴格(ge)按(an)照規定的時間和(he)溫(wen)度進行溫(wen)育以保證準確結(jie)果(guo)。所有試劑都(dou)必須在使用前(qian)達到室溫(wen)20-25℃。使(shi)用后立即冷藏(zang)保存試劑。

2. 洗板(ban)不(bu)正確可(ke)以導致不(bu)準(zhun)確的結果。在加入底物前確保盡(jin)量吸干孔(kong)內液體。溫(wen)育過程中不(bu)要讓微孔(kong)干燥(zao)掉。

3. 消(xiao)除板底殘留的(de)液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底(di)物顯(xian)色(se)(se)液(ye)應呈無(wu)色(se)(se)或很淺的顏色(se)(se)，已經變(bian)藍(lan)的底(di)物液(ye)不能(neng)使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤(wu)結(jie)果。

6. 在儲存和溫育時避免強(qiang)光直接照(zhao)射。

7. 平(ping)衡至室溫后(hou)再打開密封(feng)袋以防(fang)水滴凝聚在冷(leng)板條上。

8. 任何反應試(shi)劑(ji)不(bu)能接觸(chu)漂(piao)白溶(rong)(rong)劑(ji)或(huo)漂(piao)白溶(rong)(rong)劑(ji)所散發的(de)強烈(lie)氣體。任何漂(piao)白成分都會破壞試(shi)劑(ji)盒(he)中反應試(shi)劑(ji)的(de)生物(wu)活性。

9. 不能(neng)使用過期(qi)產品。

10. 如果可(ke)能(neng)傳播疾病，所有的(de)樣(yang)品都應管理好，按照規定(ding)的(de)程序處理樣(yang)品和檢測裝置。

試劑準(zhun)備

試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可(ke)使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋(shi)，即1份(fen)20×洗(xi)滌緩沖液加(jia)19份蒸(zheng)餾(liu)水。

操作步驟(zou)

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板(ban)條，剩余板(ban)條用自(zi)封(feng)(feng)袋密封(feng)(feng)放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各(ge)加不(bu)同濃度(du)的標準品50μL；

3.  樣本孔中(zhong)加入待測(ce)樣本(ben)50μL；空(kong)白孔(kong)不加。

4.  除空白孔外(wai)，標(biao)準品孔和樣本孔中每(mei)孔加(jia)入辣根過氧化(hua)物(wu)酶（HRP）標記的(de)檢測抗體(ti)100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水(shui)浴(yu)鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5.  棄去液體，吸水(shui)紙上拍干，每孔(kong)加滿洗(xi)滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌(di)液(ye)，吸(xi)水紙上拍干，如此重復洗板(ban)5次（也(ye)可用(yong)洗板機洗板）。

6.  每孔加入(ru)底(di)物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每(mei)孔(kong)加(jia)入終止液50μL，15min內，在450nm波(bo)長處測(ce)定各孔(kong)的OD值。

實驗結(jie)果計算(suan)

以所測標準品(pin)的OD值為橫坐標(biao)，標準品的濃度值(zhi)為(wei)縱坐標，在坐標紙上或用相關軟(ruan)件(jian)繪制標準曲線(xian)，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計(ji)算(suan)出(chu)樣品(pin)的(de)濃度。

試(shi)劑盒性(xing)能

1.  檢測范圍(wei)：0.125 ng/mL – 4 ng/mL。

2.  靈敏度：檢測濃度小(xiao)于0.1 ng/mL。

3.  特(te)異性(xing)：不與其(qi)它可溶性(xing)結構類似物交(jiao)叉反(fan)應。

4.  重復性：板內變異系(xi)數小(xiao)于10% ，板間(jian)變異(yi)系數小于15% 。