人唾液皮(pi)質醇(SC)酶聯免(mian)疫(yi)吸(xi)附測(ce)定試劑(ji)盒使(shi)用(yong)說明(ming)書(shu)

Human salivary cortisol(SC) ELISA Kit

產品貨號：RJ13602

產品規格(ge)：96T/48T

實(shi)驗原理(li)：

本(ben)試(shi)劑盒采用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被有人唾液(ye)皮質醇(SC)抗體的微孔(kong)中(zhong)，依次加入樣本、標(biao)準品、HRP標記的抗(kang)原，中間(jian)經過溫育和洗(xi)滌(di)，用底物TMB顯(xian)色，TMB在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色，并在酸(suan)的作用下轉化成最終的黃(huang)色。顏色的深(shen)淺和樣(yang)品中的人唾液(ye)皮質(zhi)醇(SC)呈負相關。用酶標(biao)儀在450nm波(bo)長下測定吸光度（OD值），計算樣(yang)品(pin)濃度。

試(shi)劑盒組(zu)成：

試劑盒參數：

需自備的設(she)備及試(shi)劑(ji)： 

1. 450±10nm 濾光片酶標儀

2. 高(gao)精度加樣器及(ji)槍頭(tou)：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL.

3. Eppendorf 移(yi)液(ye)器.

4. 蒸餾(liu)水或去離子水.

5. 脫脂(zhi)棉吸水紙.

6. 37℃恒溫箱.

8. 準(zhun)備(bei)若干個(ge)標準(zhun)品稀釋管.

樣(yang)本(ben)處理及要求：

1. 試(shi)劑盒(he)檢測范圍不等同于(yu)樣本(ben)中待測物(wu)的濃度范圍，建議實(shi)驗前通(tong)過(guo)(guo)相關(guan)文獻預估樣本(ben)中(zhong)待(dai)測物(wu)的濃度并通(tong)過(guo)(guo)預實(shi)驗確定樣本(ben)的實(shi)際濃度情況。如果樣品中(zhong)待(dai)測物(wu)濃度過(guo)(guo)高(gao)或(huo)過(guo)(guo)低(di)，請對(dui)樣本(ben)做適當的稀釋或(huo)濃縮。

2. 若所(suo)檢(jian)樣本不在說明書所(suo)列樣本之中，建議做預(yu)實驗驗證其檢(jian)測有效性。

3. 血清：將(jiang)收集于(yu)血清分離管的全血標(biao)本在室溫放置(zhi)2小時或(huo)4℃過(guo)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或(huo)將上清置于-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融(rong)。

4. 血漿：用EDTA或(huo)肝(gan)素作為抗凝劑(ji)采集標本，并將(jiang)標本在采集后(hou)的30分(fen)鐘(zhong)內于(yu)2-8℃1000×g離心15分(fen)鐘(zhong)，取上(shang)清(qing)即可檢測，或(huo)將(jiang)上(shang)清(qing)置(zhi)于(yu)-20℃或(huo)-80℃保存，但應避免反復凍融。

5. 組織勻漿：用預冷(leng)的(de)PBS (0.01M, pH=7.4)沖(chong)洗組(zu)織，去除殘留血液（勻(yun)漿(jiang)(jiang)中裂解的(de)(de)(de)紅(hong)細(xi)胞(bao)會影響測量(liang)(liang)結果(guo)），稱(cheng)重后將組(zu)織剪碎(sui)。將剪碎(sui)的(de)(de)(de)組(zu)織與(yu)對(dui)應體積的(de)(de)(de)PBS（一(yi)般按(an)1:9的(de)(de)(de)重量(liang)(liang)體積比，比如1g的(de)(de)(de)組(zu)織樣(yang)品對(dui)應9mL的(de)(de)(de)PBS，具體體積可根(gen)據實驗需要適當調整，并做好記錄。推(tui)薦(jian)在PBS中加(jia)入蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制劑）加(jia)入玻璃勻(yun)漿(jiang)(jiang)器中，于冰上充分(fen)(fen)研磨。為了(le)進一(yi)步裂解組(zu)織細(xi)胞(bao)，可以對(dui)勻(yun)漿(jiang)(jiang)液進行超聲破(po)碎(sui)，或反復凍(dong)融。最后將勻(yun)漿(jiang)(jiang)液于5000×g離心5~10分(fen)(fen)鐘(zhong)，取上清檢測。

6. 細胞培養物(wu)上(shang)清：請1000×g離(li)心20分鐘，取(qu)上清(qing)即可檢測，或將上清(qing)置(zhi)于(yu)-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍(dong)融。

7. 其它(ta)生物標本：1000×g離心20分(fen)鐘，取上清即(ji)可(ke)檢測(ce)。

8. 樣(yang)品外觀：樣品應清澈(che)透明，懸浮物應離心去(qu)除。

9. 樣品保存：樣(yang)品(pin)收集后若在1周內進行(xing)檢(jian)測(ce)(ce)的可保存(cun)于4℃，若不能及時檢(jian)測(ce)(ce)，請按一次使(shi)用(yong)量分裝，凍存(cun)于-20℃（1個(ge)月(yue)內檢(jian)測(ce)(ce)），或-80℃（6個(ge)月(yue)內檢(jian)測(ce)(ce)），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢(jian)測(ce)(ce)結果，因此溶血標本不宜(yi)進行(xing)此項檢(jian)測(ce)(ce)。

檢測前準(zhun)備工作：

1. 請提早10分鐘從冰箱中取出(chu)試(shi)劑盒，平衡至室(shi)溫(wen)。

2. 標準品梯(ti)度工作(zuo)液配制(zhi)：加入(ru)1mL通用稀釋(shi)液至凍(dong)干標準品(pin)中(zhong)，靜置15分鐘(zhong)待其溶解后輕(qing)輕(qing)混勻(濃度為20ng/mL)，然后按照以(yi)下濃度：20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.312ng/mL、0ng/mL進(jin)行稀釋。

倍比稀釋(shi)方法：取(qu)7支 EP管，每管中加入500μL通用(yong)稀釋液,500pg/mL的標準品工作(zuo)液(ye)中吸取500μL到第(di)一支EP管中混(hun)勻(yun)配成250pg/mL的(de)標準(zhun)品工作(zuo)液，按(an)此步(bu)驟往后依次吸(xi)(xi)取混勻。最后一管直接作(zuo)為空白孔，不需要再(zai)從倒數(shu)第二管中吸(xi)(xi)取液體，具體(ti)如下(xia)圖。

3. HRP-抗原工作液配制：使用前(qian)15分鐘將濃(nong)(nong)縮HRP-抗原(yuan)于1000×g離心1分鐘，以通用稀(xi)釋液將100×濃(nong)(nong)縮HRP-抗原(yuan)稀(xi)釋成(cheng)1×工(gong)作濃(nong)(nong)度(例：10μL濃(nong)(nong)縮液+990μL通用稀(xi)釋液)，當日(ri)使用(yong)。

4. 1×洗滌液(ye)配制：取(qu)10ml 20×洗滌液到190ml蒸餾水中(zhong)（從冰箱中取出(chu)的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可放置室溫(wen)，輕搖均勻，待結晶溶解后再配置)。

操作(zuo)步驟：

1. 從室溫平衡10分鐘后的(de)鋁箔袋中取出所需(xu)板(ban)條，剩余(yu)板(ban)條用自封袋密封放回4℃。

2. 加(jia)樣：分別將樣品或不(bu)同濃度標準品按照50μl每(mei)孔(kong)加入(ru)相應孔(kong)中，空(kong)白孔(kong)加入(ru)50μL通用稀釋液(ye)，緊接著每(mei)孔(kong)加入(ru)50μL HRP-抗(kang)原工作液(ye)。蓋上封板膜后(hou)37℃溫育1小時(shi)。（建議(yi)：將(jiang)待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)本用通用稀釋液(ye)稀釋1倍后(hou)再加入(ru)酶(mei)標板內測(ce)試，從而減少(shao)基質效應對測(ce)試結果的誤差影響，最后(hou)計算樣(yang)(yang)本濃度時(shi)需乘以對應的稀釋倍數。所有的待(dai)測(ce)樣(yang)(yang)本和標準(zhun)品在檢測(ce)中建議(yi)設立復孔(kong)）。

3. 洗(xi)板(ban)：棄(qi)去液體，每孔(kong)加入300μL 1x洗(xi)(xi)滌液，靜(jing)置1分鐘(zhong)，甩去(qu)洗(xi)(xi)滌液，吸水紙上拍干，如此重(zhong)復洗(xi)(xi)板(ban)3次（也可(ke)用(yong)洗(xi)(xi)板(ban)機(ji)洗(xi)(xi)板(ban)）。

4. 加底物：每孔加入底物(TMB)90μL，蓋上封板膜，37℃避光溫育(yu)15分鐘。

5. 加(jia)終止(zhi)液：每孔加(jia)入終止(zhi)液50μL，立即在450nm波長(chang)處(chu)測(ce)定各孔(kong)的OD值。

結果判斷：

1. 計算標準品和樣本復孔的(de)平均OD值。以濃度為橫坐(zuo)標(biao)，OD值為縱坐(zuo)標(biao)，在(zai)雙(shuang)對數坐(zuo)標(biao)紙(zhi)上繪出(chu)四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2. 若樣品OD值低(di)于標(biao)準曲線上限(xian)，應(ying)適當(dang)稀(xi)釋后重測并在計(ji)算樣本(ben)濃度時乘以相應(ying)的稀(xi)釋倍(bei)數。

典型數據和參考曲線：

以下(xia)數據和(he)曲線僅(jin)供參考，實驗者(zhe)需(xu)根據自己的實驗建立標準曲線。

注意：本圖(tu)僅供參考，應以同次(ci)試(shi)驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

試劑盒(he)性能：

1. 重(zhong)復(fu)性：板(ban)內變異系數(shu)小于10%，板間變異系數小于10%。

2. 回收率：在選取(qu)的健康人血(xue)清、血漿和(he)細胞培養(yang)上清中加入3個(ge)不同(tong)濃度水平(ping)的(de)人SC，計算(suan)回(hui)收率

3. 線性(xing)稀釋：分別在選(xuan)取的4份(fen)健(jian)康人(ren)血清、血漿和細胞培養(yang)上清中(zhong)加入高濃度(du)人SC，在(zai)標(biao)準曲線(xian)(xian)動力學范圍內進行稀(xi)釋，評估線(xian)(xian)性。

注意(yi)事項(xiang)：

1. 嚴格按照(zhao)規定的(de)時間和溫度進行溫育以保證(zheng)準確(que)結(jie)果(guo)。所有試劑都必須在使(shi)用前達到(dao)室溫20-25℃。使用(yong)后立(li)即冷藏保存試劑。

2. 洗(xi)板不正確可以導致不準(zhun)確的結果。在(zai)加入底物前確保盡量(liang)吸干孔(kong)內液體。溫育過程中不要讓微孔(kong)干燥掉。

3. 消除(chu)板底殘留的液(ye)體(ti)和手指印，否則(ze)影(ying)響OD值。

4. 底(di)物顯色液應呈無(wu)色或很(hen)淺(qian)的(de)顏色，已經變藍(lan)的(de)底(di)物液不能使用。

5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成(cheng)錯誤結果。

6. 在儲存和溫(wen)育時避(bi)免(mian)強光直接照射(she)。

7. 平衡至室溫后再打開密封(feng)袋以防水滴凝聚在冷板條(tiao)上。

8. 任何反應試劑(ji)不能接觸漂(piao)白(bai)溶(rong)劑(ji)或漂(piao)白(bai)溶(rong)劑(ji)所散發的強烈氣體(ti)。任何漂(piao)白(bai)成分都會破(po)壞(huai)試劑(ji)盒(he)中反應試劑(ji)的生物活(huo)性。

9. 不能使(shi)用過(guo)期產(chan)品(pin)。

10. 如果可能傳(chuan)播疾病，所有的樣品(pin)都(dou)應管理(li)好，按照規定的程(cheng)序(xu)處理(li)樣品(pin)和檢測(ce)裝(zhuang)置。