【檢(jian)驗原理(li)】

本試(shi)劑盒(he)針對小反(fan)芻獸疫病毒的高度保守區域設計特異性引(yin)物和探(tan)針，在反(fan)應體系中含小反(fan)芻獸疫病毒基因組(zu)模板(ban)的情況(kuang)下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【主要組(zu)成(cheng)(cheng)成(cheng)(cheng)份(fen)】

注(zhu)：陰(yin)性對照為偶(ou)蹄獸類基因組DNA，陽性對照為失去活性的小(xiao)反芻獸疫病毒cDNA。

【儲存(cun)條(tiao)件(jian)及(ji)有(you)效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等(deng)多通道實時熒光(guang)定量PCR儀。

【樣本要(yao)求(qiu)】

1. 適(shi)用標本類型：發(fa)病動物血液、空腸(chang)(chang)及小腸(chang)(chang)腸(chang)(chang)內容(rong)物及組織(zhi)臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養液。

2. 標本采集，方法如下：

(1) 血清：用一次(ci)性注射(she)器取靜脈血2-3ml，轉(zhuan)至5ml 的干燥管中(zhong)，密閉送檢。

(2) 腸內容物：無菌(jun)條件下(xia)取腸道內容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理(li)鹽水)的5ml 離心(xin)管(guan)中(zhong)，立即(ji)送(song)檢。

(3) 組(zu)織臟器：取發病動物腸道組(zu)織及(ji)腸系膜(mo)淋巴結(jie)等(deng)組(zu)織約1g，置(zhi)一1.5ml的潔凈離心(xin)管(guan)中(zhong)，密(mi)閉(bi)送檢。

3.應避免標本(ben)間交(jiao)叉污(wu)染。

4.標(biao)本收集(ji)后可立即檢測；若不能(neng)立即檢測，可置于2～8℃冷藏(zang)過(guo)夜保存；如(ru)需長期保存，標本應凍存(cun)于-80℃以下，避免反復凍融。

【檢驗方法】

1. 試劑(ji)準(zhun)備（試劑(ji)準(zhun)備區）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰(yin)性(xing)對照數(shu)（1T）+陽(yang)性(xing)對照數(shu)（1T）+誤(wu)差(cha)預(yu)留量（1T）+樣本(ben)數(shu)

（3）在無菌離心(xin)管(guan)中加入上述試劑，充分混(hun)勻后瞬時(shi)離心(xin)。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣本(ben)準備（樣本(ben)處(chu)理(li)區）

用QIAGEN、Roche公司(si)RNA提(ti)取(qu)試劑(ji)盒(he)提(ti)取(qu)RNA，具體操作(zuo)按照其試劑(ji)盒(he)說明書(shu)操作(zuo)。

3.加樣

在(zai)上述制備(bei)好(hao)的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴(kuo)增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參考(kao)值（參考(kao)范圍(wei)）】

1.試劑盒有效性判(pan)定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標本結果判定：

（1）陽性：標本(ben)檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可(ke)疑：標本檢測(ce)結果Ct值在(zai)35～38范(fan)圍內(nei)。此時(shi)應對標本(ben)進行重復檢測(ce)，如重復實驗結(jie)果(guo)Ct值仍在(zai)35～38范(fan)圍內(nei)，有明顯指數增長期，則(ze)判定為陽性，否則(ze)為陰性。

（3）陰性：標本檢(jian)測結果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】