預期用途】

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV) 屬于小RNA病毒科，口(kou)蹄疫病毒屬，主要侵害偶蹄獸，有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia-I七個血清型。口蹄疫發病(bing)以(yi)發(fa)熱、口腔黏膜及蹄(ti)部(bu)和乳房皮(pi)膚發(fa)生水泡和潰爛為(wei)特征，是國際獸疫局規定的A類傳染病，易通過空氣傳播，傳染性強，流行迅速，偶爾感染人。由于口(kou)蹄疫傳播迅速、難于防治、補救措施少，被稱為畜牧業的“頭號殺手"。

本試劑(ji)盒利用實(shi)時熒(ying)光PCR原理(li)，定性檢測口蹄(ti)疫O型病毒（FMDV-O)，對FMDV-O引起的偶蹄獸類病的診(zhen)斷和監控具有重要(yao)指導意義(yi)。

【檢驗(yan)原(yuan)理】

本(ben)試(shi)劑盒針(zhen)對口(kou)蹄疫病(bing)毒O型的高度(du)保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含口蹄疫病毒O型基因組(zu)模板的情(qing)況(kuang)下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監測和輸出，實現檢測結果的定性分析。

【主(zhu)要組成成份】

注：陰性對照為偶蹄(ti)獸類基因(yin)組DNA，陽性對照為失去活性的FMDV-O病毒cDNA。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個月。

【適(shi)用儀器(qi)】ABI 系(xi)(xi)(xi)列(lie)(lie)、Bio-Rad系(xi)(xi)(xi)列(lie)(lie)、Agilent Stratagene MX系(xi)(xi)(xi)列(lie)(lie) 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系(xi)(xi)(xi)列(lie)(lie)、杭州博(bo)日系(xi)(xi)(xi)列(lie)(lie)等多通道實(shi)時(shi)熒光(guang)定量PCR儀(yi)。

【樣本要求】

新鮮采(cai)集的咽拭子、皰疹液(ye)和(he)糞便標本(ben)，并使用滅菌生理鹽水(shui)懸浮。

2.應避免標本間交叉污染。

3.標本(ben)收集后可立即檢測；若不能立即(ji)檢測，可(ke)置于2～8℃冷(leng)藏過(guo)夜(ye)保存(cun)(cun)；如需(xu)長期保存(cun)(cun)，標本應凍存于-80℃以(yi)下(xia)，避免反復凍(dong)融(rong)。

【檢驗方法】

1. 試(shi)(shi)劑準(zhun)備（試(shi)(shi)劑準(zhun)備區）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照(zhao)數（1T）+陽性對照(zhao)數（1T）+誤(wu)差(cha)預留量（1T）+樣本(ben)數

 (3)在無(wu)菌離(li)心管中加入(ru)上述試(shi)劑，充分混勻后瞬時離(li)心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。

2.樣(yang)本(ben)準備（樣(yang)本(ben)處理區）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。

3.加樣(yang)

在上(shang)述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管(guan)，蓋好PCR反應蓋混(hun)勻(yun)后瞬(shun)時低速(su)離(li)心，轉(zhuan)移(yi)到PCR儀(yi)器上(shang)。陰(yin)性對照(zhao)(zhao)和陽(yang)性對照(zhao)(zhao)管(guan)則(ze)各加5 μL試劑盒自帶(dai)的陰性對(dui)照(zhao)或陽性對(dui)照(zhao)品，終體積為25 μl/管，蓋(gai)好PCR反應蓋(gai)混(hun)勻(yun)后瞬時低速離心(xin)，轉移(yi)到PCR儀器上。

4. PCR（PCR擴(kuo)增區）

（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參(can)(can)考(kao)值（參(can)(can)考(kao)范(fan)圍）】

1.試(shi)劑(ji)盒有效性(xing)判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。

2.標(biao)本結果判(pan)定：

（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。

（2）可疑：標本檢測(ce)結果Ct值在35～38范(fan)圍內。此時應對標本進行重復檢(jian)測，如重復實驗(yan)結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯(xian)指(zhi)數增長(chang)期，則判(pan)定為陽(yang)性，否則為陰性。

（3）陰性：標(biao)本檢測(ce)結果(guo)Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗結果的解釋】

【檢驗方法的局限性(xing)】

1. 當檢測(ce)樣(yang)本中(zhong)被(bei)檢核酸濃(nong)度低于本試劑(ji)盒的檢出可能會發生(sheng)假(jia)陰性的結(jie)果。

2. 被檢樣本在采集、運輸(shu)、儲存以(yi)及處理過程中操(cao)作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。

3. 樣本(ben)在采(cai)集、運輸、儲(chu)存(cun)以及處理(li)過程中(zhong)發生(sheng)交(jiao)叉(cha)污染(ran)，則(ze)容易得到假陽性結果(guo)。

【產(chan)品性能指(zhi)標】 產(chan)品的(de)檢出限為10² Copies/mL，產品CV值≤5%。

【注意事項】

1. 整個(ge)檢測(ce)過程應嚴(yan)格按照本(ben)(ben)說明書(shu)要求分別在試劑(ji)準備區、樣本(ben)(ben)處(chu)理區和PCR擴增(zeng)區(qu)(qu)進(jin)行操作(zuo)，各區(qu)(qu)實(shi)驗(yan)服、儀器(qi)、耗材應(ying)獨立使用(yong)，不(bu)能混用(yong)；實(shi)驗(yan)用(yong)吸頭采用(yong)帶濾芯吸頭；樣(yang)本處(chu)理區(qu)(qu)應(ying)配有生物安(an)全(quan)柜，樣(yang)本處(chu)理在生物安(an)全(quan)柜中進(jin)行操作(zuo)；三個區(qu)(qu)應(ying)該配有紫外線殺菌裝(zhuang)置。

2. 為(wei)避(bi)免RNA降(jiang)解，樣本(ben)處理過程應在0-4℃條件(jian)下操作，且完成實驗后(hou)立即上機(ji)檢測；樣本處理過(guo)程(cheng)中使用的器(qi)具耗材應經過(guo)無(wu)核酶處理。

3. 每次實驗(yan)應該設(she)置陰、陽(yang)性對(dui)照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(ying)(ying)該(gai)在常溫(wen)下充分(fen)融(rong)化(hua)混勻，并應(ying)(ying)瞬時(shi)離(li)心。

5. 試劑盒內所(suo)配陰(yin)性(xing)和陽(yang)性(xing)對照在第一次使用前應全部轉移(yi)至標本準備(bei)區，并單(dan)獨存放。

6. 為防止(zhi)熒光干(gan)擾(rao)，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免(mian)在PCR反應管上(shang)進行任(ren)何標記。

7. 儀(yi)器擴增相關參數應按照本(ben)說明(ming)書相關要求進行設(she)置；不同批號試劑(ji)不能混用。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅(mie)基因選擇None。

9. 實驗過程中產(chan)品的(de)廢(fei)棄物應該進行無害化處理后方可丟棄。