小鼠甲狀腺(xian)素(su)（T4）定(ding)量(liang)檢測試劑盒（ELISA）操作方法

實驗原理

本試劑(ji)盒(he)采用競爭(zheng)法酶(mei)聯免疫(yi)吸附試驗（ELISA）。在(zai)預包被抗(kang)小(xiao)鼠(shu)甲狀(zhuang)腺素(su)(su)（T4）抗(kang)體（固相抗(kang)體）的微孔酶(mei)標(biao)板中(zhong)，加入(ru)小(xiao)鼠(shu)甲狀(zhuang)腺素(su)(su)（T4）校準品和待測(ce)樣本(ben)，再加入(ru)HRP標(biao)記的小(xiao)鼠(shu)甲狀(zhuang)腺素(su)(su)（T4）抗(kang)原（酶(mei)標(biao)抗(kang)原），經過(guo)溫育(yu)與充分洗滌，去除未結合(he)的組分，在微(wei)孔板固相表面形成(cheng)固相抗體-酶標抗原(yuan)的免疫復合物。加底(di)物A和B，底(di)物在(zai)HRP催化(hua)下，產生(sheng)藍(lan)色(se)產物，在(zai)終止液（2M 硫酸）作用(yong)下，最(zui)終轉化(hua)為黃色(se)，在(zai)酶標儀(yi)450nm波長上測(ce)定吸(xi)光度（OD值），吸光度(du)（OD值）與待測樣(yang)品中小鼠甲(jia)狀腺(xian)素（T4）的濃(nong)度(du)負相關(guan)。擬(ni)合校準品曲線，可以計算出樣(yang)本中小鼠甲(jia)狀腺(xian)素（T4）的濃(nong)度(du)。

試劑盒限制性

1、 僅(jin)供(gong)科研使用(yong)，不得用(yong)于臨(lin)床診斷。

2、 在(zai)試劑盒標(biao)示的有(you)效期(qi)內使(shi)用(yong)(yong)，過(guo)期(qi)產品不得使(shi)用(yong)(yong)。

3、 跟其他廠(chang)家(jia)的試劑盒或者(zhe)組分(fen)不能混用。

4、 使用試劑盒配(pei)套的樣品(pin)稀釋液(ye)。

5、 如果樣本值高于最高標準品濃度(du)值，請將樣本適當稀(xi)釋后，再重新測(ce)定。

6、 待測樣本(ben)中存在的(de)人(ren)抗(kang)鼠等(deng)異嗜抗(kang)體會干擾檢測結果，檢測前，請排出該因素。

7、 通過其他方(fang)法得到的(de)檢(jian)測結果(guo)，與本試(shi)劑盒(he)測定結果(guo)不(bu)具(ju)有(you)直接的(de)可比性。

技術提示

1、 混合蛋白(bai)溶液時(shi)，避(bi)免(mian)起(qi)泡。

2、 加校準(zhun)品與(yu)樣(yang)本時，每個校準(zhun)品濃度和樣(yang)本都(dou)要更換(huan)移(yi)液槍頭，公共(gong)組分應(ying)該懸臂加樣(yang)，避免交叉污染(ran)。

3、 合適的(de)溫育時間(jian)，和充分的(de)洗滌步驟(zou)，是保(bao)證實(shi)驗(yan)結果準(zhun)確性的(de)必(bi)要條(tiao)件。

4、 使用自(zi)動洗板(ban)機時，加入一個30秒浸泡的步(bu)驟，可(ke)以提高檢測(ce)精度(du)。

5、 底物溶液為(wei)無色液體(ti)(ti)，保存過程中變為(wei)藍色，代表底物溶液已經失效，不得(de)使用。

6、 終(zhong)止(zhi)液(ye)加樣順(shun)序與底(di)物溶(rong)液(ye)加樣順(shun)序一致(zhi)，加入終(zhong)止(zhi)液(ye)后，藍色(se)底(di)物產物，會瞬間變為(wei)黃色(se)。

7、 實驗(yan)中(zhong)，用剩的板(ban)條，應立即放回自(zi)封袋中(zhong)，密封（低溫干燥）保(bao)存。

8、 所有液(ye)體(ti)組分，使用前充分搖勻，嚴格按照說明書標明的時間、加(jia)樣量及加(jia)樣順序進行溫育操作(zuo)。

試(shi)劑盒組(zu)分與保存

未開封的試(shi)劑盒保存在(zai)2-8度，不得使用(yong)過(guo)期試劑盒。

標準品濃度依次(ci)為：64、32、16、8、4、0 ng/mL.

其他用品

1、 酶標儀(yi)（450nm）

2、 精密移液器(qi)及一次性吸頭

3、 蒸(zheng)餾水(shui)

4、 洗瓶或者自(zi)動(dong)洗板機

5、 37℃水浴鍋或恒(heng)溫(wen)箱

6、 500ml量筒

生物安全

1、 檢測(ce)必須符(fu)合(he)實(shi)驗室管(guan)理規(gui)范的規(gui)定(ding)，嚴(yan)格防止(zhi)交叉(cha)污染(ran)(ran)，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(ying)按照傳染(ran)(ran)物進行處置。

2、 試劑盒的液體組(zu)分中，含有proclin-300防腐(fu)劑，可能(neng)引起皮膚過(guo)敏反(fan)應，避免吸(xi)入煙霧(wu)與皮(pi)膚接(jie)觸。

3、 底物液對皮膚、眼(yan)睛和上呼吸(xi)道(dao)有刺激作用，避(bi)免吸(xi)入煙霧。

4、 戴上防護手套，實驗完成(cheng)后洗手。

樣品的采集和儲存(cun)

以下只是列出(chu)樣品采集和保存(cun)的(de)一般(ban)指南。所有樣本(ben)采集保存(cun)過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐(fu)劑(ji)。

1、 細胞培養上清：4000rpm條件(jian)下(xia)離心20min，去除細胞(bao)顆(ke)粒(li)和聚合物，上清液保存在- 20℃以下(xia)，避免反復(fu)凍融。

2、 血(xue)清：使(shi)用不(bu)含熱原和內毒素的試管，操作過程中避(bi)免任何細胞刺激(ji)，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出(chu)血清，保存在-20℃以下，避(bi)免反復凍(dong)融。

3、 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下(xia)，離(li)心20分鐘(zhong)取上清(qing)，血(xue)漿保存在-20℃以下，避免(mian)反復凍融(rong)。

樣本收(shou)集后，無法(fa)一(yi)次檢測完畢，請按一(yi)次用量分(fen)裝凍(dong)存，避(bi)免反復凍(dong)融(rong)，使用時(shi)在室溫下(xia)解凍(dong)，確保(bao)樣品(pin)均勻充分(fen)解凍(dong)。

4、 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的(de)重量體積比，比如1g的組(zu)織(zhi)樣品(pin)對(dui)應9 mL的PBS，具體(ti)體(ti)積可根據實驗(yan)需要(yao)適當調整(zheng)，并做好記錄。推(tui)薦在PBS中加(jia)(jia)入蛋(dan)白酶抑(yi)制劑(ji))加(jia)(jia)入玻(bo)璃(li)勻漿器中，在冰上充(chong)分研磨(mo)。為了(le)進(jin)一步(bu)裂解組(zu)織(zhi)細胞，可以對(dui)勻漿液進(jin)行超聲破碎(sui)或反復凍(dong)融(rong)。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢(jian)測。

5、 細胞(bao)提取液：貼壁細胞(bao)用冷(leng)的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復凍融使(shi)細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。  

6、 其他生(sheng)物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

試劑(ji)準備(bei)

1、 使用(yong)前，所有(you)的組(zu)分都要至(zhi)少復(fu)溫60min，確保充分復溫到室溫。

2、 濃縮洗滌(di)液：從冰箱(xiang)取出的濃縮洗滌(di)液，會有結(jie)晶產生(sheng)，這屬(shu)于正常現象，水浴(yu)加熱使(shi)結(jie)晶溶解。濃(nong)縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液(ye)，添加19份(fen)的蒸餾水。

3、 底物：底物(wu)液A和B，在使用前，按(an)1:1體積充分混(hun)合，混合后(hou)15分(fen)鐘(zhong)內(nei)使用。

操作程序

所有試劑(ji)和(he)組分都先恢復到(dao)室溫，標準品、質控品和(he)樣品，建議做復孔。

1、 按前面說(shuo)明書描述的方法(fa)，配制好試劑盒各種(zhong)組分(fen)的工(gong)作液(ye)。

2、 從(cong)鋁(lv)箔(bo)袋(dai)中(zhong)取出所(suo)需板條，剩(sheng)余的板條用自封袋(dai)密封放(fang)回冰箱。

設置(zhi)標準(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)、空白孔(kong)(kong)(kong)和(he)樣(yang)本孔(kong)(kong)(kong)，標準(zhun)品(pin)孔(kong)(kong)(kong)各(ge)加不同濃(nong)度的標準(zhun)品(pin)50μL，空白孔不加，樣(yang)本孔加待測樣(yang)本50μL。

3、除空(kong)白孔(kong)(kong)外(wai)，標準品孔(kong)(kong)和(he)樣本孔(kong)(kong)，加入辣根過氧化物(wu)酶（HRP）標記的檢測抗原100μL。

4、 用封板(ban)膜蓋住反應板(ban)，37℃水(shui)浴鍋或恒溫(wen)箱溫(wen)育60min。

5、 揭開封板(ban)膜，棄去液(ye)體，吸水紙上(shang)拍(pai)干(gan)，每孔加滿洗(xi)滌液(ye)，靜(jing)置20S，甩去洗(xi)滌(di)液，吸水(shui)紙(zhi)上拍干，如此(ci)重復(fu)5次。若使用自動洗板機，請按(an)洗板機操作程序進行洗板，添加(jia)浸泡(pao)30s的程序，可以提高檢(jian)測的精(jing)度。洗板結(jie)束，加(jia)底物前(qian)，要(yao)在干凈不掉屑的紙上(shang)，充分(fen)拍干反應(ying)板。

6、 將(jiang)底(di)物A和(he)B按1:1體(ti)積充分混合，所有(you)孔(kong)中加入底(di)物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或(huo)恒溫(wen)箱溫(wen)育15min。

7、 所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上(shang)讀取各孔吸光度(du)（OD值）。

結果計算

1、 以標(biao)(biao)準品濃度做為橫(heng)坐(zuo)標(biao)(biao)，對(dui)應的吸光度（OD值）作為縱(zong)坐標，利用計算(suan)機(ji)軟件，采用四參(can)數Logistic曲線擬合（4-pl），創建標準曲線方程(cheng)，通過樣本的(de)吸(xi)光度（OD值(zhi)），利用方程計算樣品的濃(nong)度值(zhi)。

2、 如果樣品被(bei)稀釋，通過上述方(fang)法測的(de)濃度值，要乘以稀釋倍(bei)數，才是樣品的(de)最終濃度。

試劑盒性能指標

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(ying)澄清透明、無(wu)沉淀或者(zhe)絮狀物。微孔板(ban)鋁(lv)箔袋應(ying)真空包裝，無(wu)破損漏氣(qi)。

2、劑量反(fan)應曲線線性

校準(zhun)品(pin)劑(ji)量反應曲線相關系數r值(zhi)，大于(yu)等于(yu)0.9900。

3、精密度(du)

批內精(jing)密度：三組已知(zhi)的高、中、低濃度樣品，進(jin)行(xing)二十次在同(tong)一個(ge)板塊內精度評估。批內變異系數CV%小(xiao)于10%。

批間精密(mi)度：三組已知的高、中、低濃度(du)樣品(pin)，進行(xing)二十次在不(bu)同板塊內(nei)精(jing)度評估。批間(jian)變異系數CV%小于(yu)15%。

4、靈敏度

小(xiao)于0.1 ng/mL。

5、回收(shou)率

三組(zu)已(yi)知的高、中(zhong)、低濃度樣品，進行五次在同一個(ge)板塊(kuai)內回收(shou)率(lv)評估，回收率(lv)在85%-115%之間。

6、特(te)異(yi)性

本試(shi)劑盒識別天然和重組小(xiao)鼠甲(jia)狀腺素(su)（T4），與結構類(lei)似物無交叉。

7、穩定性

2℃-8℃保存，有(you)效期6個(ge)月。

8、 檢測范圍

2 ng/mL - 64 ng/mL